①过表达质粒构建

简介：

过表达质粒构建服务是将目的基因的cDNA序列连接到不同的质粒载体上，通过质粒构建获得过表达目的基因的质粒。

目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一。过表达质粒已经广泛应用于生物学研究，包括基因调控、蛋白质工程、重组抗体制备、药物研发等。将目的基因通过转染或病毒包装的方法，能够实现目的基因过表达的稳定细胞系。过表达的基本原理是通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。

贵州双螺旋生物提供的过表达质粒产品适合于人源、小鼠、大鼠等物种的基因的表达。

特点：

根据不同的实验目的，在进行基因过表达过程中，可以选择不同的过表达载体。过表达载体与克隆载体比较而言，加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体，在识别质粒时可以根据以下几种表达调控元素：

（1）启动子：促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNA pol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

（2）增强子/沉默子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。

（3）核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和 SD序列。

（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点下游有一段GT或T富丰区，这2部分共同构poly（A）加尾信号。

服务流程：

优势：

（1）贵州双螺旋生物具有专业的技术研究团队和丰富的分子克隆经验；

（2）贵州双螺旋生物目前已有多种工具载体可选，应用于各种表达系统；

（3）可根据客户需求构建不同的目的载体。

②干扰质粒构建

简介：

根据客户研究的目的基因设计shRNA，并将其克隆到相应的载体，转染细胞即可实现抑制基因表达的目的；与化学合成的siRNA相比，质粒性质更稳定，且对基因的抑制持续时间更长。

RNA干扰现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。

RNAi提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。

特点：

shRNA是可以克隆至表达载体并表达双链siRNA的RNA分子，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔，形成发夹结构，由polⅢ启动子控制。相对于siRNA，shRNA在细胞核中合成，进一步加工并运输到细胞质中，然后进入RISC发挥活性。miRNA的合成与成熟研究为shRNA的合成，特别是基于miR-30的shRNA的合成提供了基础。

shRNA表达载体进入细胞质后，需要转运到细胞核中进行转录。初级转录本（Pri-shRNA）由Drosha/DGCR8复合物处理形成pre-shRNA。Pre-shRNA被运输到细胞质中，装载到Dicer/TRBP/PACT复合物上，随后被进一步加工成成熟的shRNA。成熟shRNA与含有RISC的Argonaute蛋白相关，介导mRNA的切割和降解或处理小体（P-bodies）的翻译抑制，行使RNA干扰功能。

服务流程：

优势：

（1）贵州双螺旋生物具有专业的技术研究团队和丰富的分子克隆经验；

（2）贵州双螺旋生物目前已有多种工具载体可选，应用于各种表达系统；

（3）可根据客户需求构建不同的目的载体。

③突变/截短质粒构建

简介：

体外定点突变技术是当今分子生物学功能实验和医学研究领域的核心技术。该技术通过修改克隆上的碱基从而改变功能序列的编码特性，广泛应用于各种领域研究：基因调控因子，DNA和蛋白相互作用，蛋白结构和功能，酶学活性位点的确定等，定点突变还是深入研究基因功能必须进行的实验。

截短基因是一段序列被删除而变短的基因。通过剪切或删除基因组中的特定区域，产生长度较短的基因分子，也常用于基因结构域功能研究。

贵州双螺旋生物为广大客户提供最快捷、最精确的定点突变、截短服务，可对任何位置的位点、大片段的基因、含有重复序列或高GC（70%以上）的序列进行突变，不限制位点，无需考虑克隆策略，可点突变长片段克隆，删除指定序列，本公司优化过的点突变技术可以操作多达12Kb的长片段克隆。

特点：

（1）使用质粒载体进行突变序列构建或截短序列构建，通过外源表达实现其功能验证，方便快捷，节省实验周期和成本。

（2）通过化学合成的方式得到的突变序列准确且迅速。

（3）质粒具有稳定、可扩增的特性，瞬转目的细胞即可进行验证。

服务流程：

优势：

（1）贵州双螺旋生物具有专业的技术研究团队和丰富的分子克隆经验；

（2）贵州双螺旋生物目前已有多种工具载体可选，应用于各种表达系统；

（3）可根据客户需求构建不同的目的载体。

④荧光素酶报告基因质粒构建：

简介：

根据客户的实验需求及待研究的目的基因，将特定的片段构建到相应的报告基因载体上，用于基因表达调控作用，信号通路，SNP作用等相关研究。

贵州双螺旋可提供UTR报告基因质粒，启动子荧光素酶报告基因质粒，SNP等其他报告基因。

特点：

报告基因（reporter gene）是一种编码可易于鉴定的蛋白质或酶的基因，其与目的基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控，广泛应用于基因调控、RNA互作等研究领域。

作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:

（1）已被克隆或全序列已被测定;

（2）表达产物在受体细胞中不存在，在被转染细胞中无相似的内源性表达产物;

（3）其表达产物容易被检测到。

报告基因质粒是整合有报告基因的重组质粒。根据不同的研究方向需要构建的基因序列及使用载体不同。其构建方式主要参考待研究序列在基因上的位置。常用的启动子报告基因载体有pGL3-basic载体。载体含Luciferase荧光素酶报告基因，无启动子，用于研究目的启动子的功能，在Luciferase上游包含一个多克隆位点，用于插入启动子序列，若Luciferase荧光素酶活性上升，说明该段启动子受到转录因子的调控。

常用的3’UTR报告基因载体为PGL3-CMV-LUC-MCS。该载体包含一个CMV启动子控制下的luciferase报告基因。在luciferase的3'UTR区域包含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。

服务流程：

优势：

（1）贵州双螺旋生物具有专业的技术研究团队和丰富的分子克隆经验；

（2）贵州双螺旋生物目前已有多种报告基因载体可选，应用于各种报告基因研究系统；

（3）可根据客户需求构建不同的目的载体